Викладач Стоянова Л.П. Предмет Мікробіологія Група 2 – Б л/с Дата Згідно розкладу 23.10.2020 Тема 5 Практика Тема:Серологісні реакції та їх застосування СХЕМА ДИСТАНЦІЙНОГО НАВЧАННЯ Тема. Серологічні реакції, їх застосування Мета заняття: — навчитися пояснювати роль антигенів як індукторів імунної відповіді; — навчитися пояснювати роль антитіл в імунній відповіді; — розуміти суть серологічного методу дослідження; — мати поняття про діагностичні препарати; — уміти проводити реакцію аглютинації. Оснащення: адсорбована аглютинуюча полівалентна ешерихіозна сироватка ОКА в ампулах і розчинена та розлита у стерильні пробірки, в які вмонтовані пастерівські піпетки, стерильний ізотонічний розчин натрію хлориду (у пробірках), стерильні піпетки об'ємом 1—2 смЗ, гумова груша, чиста культура Е. соїі на скошеному МПА, предметні стекла, бактеріологічні петлі, пінцети, спиртівка, сірники, маркери, дезінфекційний розчин, спирт, ката, заздалегідь поставлена розгорнута реакція аглютинації, бланк направлення. Контроль вихідного рівня знань 1. Серологічні реакції, їх застосування. 2. На чому ґрунтується серологічний метод діагностики? 3. Які серологічні реакції найбільш широко використовуються в лабораторній практиці? 4. На яких властивостях серологічних реакцій ґрунтується їх застосування? 5. Які проблеми вирішують за допомогою серологічних реакцій? 6. Який посуд використовують для проведення серологічних реакцій? Яким вимогам він має відповідати? 7. Які інструменти і яку апаратуру використовують для проведення серологічних реакцій? 8. Які сироватки називають імунними діагностичними? Як їх виготовляють? 9. Чим відрізняються нативні імунні діагностичні сироватки від адсорбованих? Яка різниця у їх використанні? 10. Що таке титр сироватки? 11. Які антитіла називають специфічними, які — неспецифічними? 12. Які адсорбовані сироватки називають монорецепторними, які — полівалентними? 13. Що таке аглютинація? За якою ознакою її виявляють? 14. З якою метою проводять реакцію аглютинації на склі? 15. У чому полягає принцип проведення реакції аглютинації на склі? 16. Як враховують результати реакції аглютинації на склі? 17. З якою метою використовують розгорнуту реакцію аглютинації? 18. Які інгредієнти використовують у разі проведення розгорнутої реакції аглютинації? 19. Яких умов слід дотримуватися у разі забору крові на серологічне дослідження? 20. Як оформляють і доставляють у лабораторію взяту на дослідження кров? 21. Як отримують і за яких умов зберігають сироватку крові? 22. Який антиген використовують для серологічної діагностики захворювання? У якій формі його випускають? Як перевіряють його на придатність? 23. Який посуд використовується у разі проведення розгорнутої реакції аглютинації? 24. За якими ознаками слід підбирати пробірки? 25. Як маркірують посуд для проведення реакції аглютинації? 26. Як проводять титрування сироватки? 27. За яких умов і впродовж якого часу відбувається розгорнута реакція аглютинації? 28. Як враховують результат реакції аглютинації? 29. Як визначають титр сироватки, як його зазначають у відповіді? 30. Як за допомогою реакції аглютинації відрізнити хворого від того, що перехворів або був щеплений? Практичні навички: Проведення орієнтовної реакції аглютинації на склі. Облік та оцінювання її результатів. Демонстрація розгорнутої реакції аглютинації. Облік та оцінювання її результатів. 1. Серологічні реакції, їх застосування Ознайомтеся з умовами проведення серологічних реакцій та їх застосуванням. Серологічні реакції ґрунтуються на взаємодії антигену зі специфічним антитілом. Оскільки ці реакції високоспецифічні, чутливі і можуть відбуватися in vitro, їх широко використовують у лабораторній практиці. За допомогою серологічних реакцій можна вирішити дві проблеми: 1) визначити невідоме антитіло або невідомий антиген у сироватці крові хворого — серологічна діагностика; 2) визначити рід, вид, тип збудника, виділеного із патологічного матеріалу хворого, — серологічна ідентифікація культури мікроорганізмів. Проведення серологічних реакцій потребує підготовки посуду, інструментів, апаратури й окремих інгредієнтів (від лат.іngrеdіеnt— той, що входить), тобто окремих компонентів реакції: антитіла, антигену і неспецифічних компонентів. Для постановки серологічних реакцій використовують чистий, сухий скляний посуд: аглютинаційні, преципітаційні, центрифужні пробірки, піпетки градуйовані (або піпеточний дозатор) і пастерівські, чашки Петрі, предметні стекла. Скло має бути прозорим, без плям і подряпин. Для проведення серологічної реакції у пробірках слід підібрати їх так, щоб вони були однаковими за висотою і діаметром, мали однакову конфігурацію дна, однаковий колір скла. Замість пробірок часто використовують полістиролові планшети багаторазового й одноразового використання. На планшеті є лунки, однакові за розміром і конфігурацією дна. їх використовують для постановки реакцій гемаглютинації, мікропреципітації, ІФА. Використовують такі інструменти й апаратуру: бактеріологічну петлю, пінцет, штативи з гніздами, що відповідають діаметру пробірок, лупу, аглютиноскоп, термостат, холодильник, центрифугу на 2000—3000 об/хв. Специфічними компонентами серологічних реакцій є імунна діагностична сироватка (відоме антитіло) і діагностикум (відомий антиген). Імунними діагностичними називають сироватки, що містять відомі специфічні антитіла. їх виготовляють із крові тварин (кроликів, коней, ослів, овець), яких попередньо імунізують (заражають) відповідним антигеном (мікробами чи токсином) за певною схемою. Після накопичення антитіл (приблизно через 2 тиж після останнього введення антигену) беруть кров і виробляють із неї сироватку. В отриманій сироватці визначають активність (титр). Титр — це найбільше розведення, в якому сироватка спричинює видиму реакцію з відповідним антигеном в умовах досліду. Сироватки розливають в ампули, частіше їх ліофідізують, потім запаюють. На ампулі зазначають назву сироватки, її об'єм і титр. Перед використанням їх розчиняють у дистильованій воді або ізотонічному розчині натрію хлориду (як зазначено в інструкції). Зберігають сироватки у холодильнику за температури від 4 до 10 °С. Імунні діагностичні сироватки бувають нативні (неадсорбовані) й адсорбовані. Неадсорбовані сироватки містять природні антитіла, які накопичилися в крові упродовж життя тварини, групові антитіла, які здатні взаємодіяти з бактеріями, що мають однакові антигени (бактерії одного роду, родини), — це неспецифічні антитіла та специфічні антитіла, які здатні взаємодіяти з бактеріями, що були використані для імунізації тварин. Імунна діагностична сироватка містить набагато більше специфічних антитіл, ніж неспецифічних. Після розведення неадсорбованпх сироваток концентрація неспецифічних антитіл стає настільки малою, що вони не здатні спричинити,видиму реакцію з антигеном, а концентрація специфічних антитіл хоч і зменшується, але залишається достатньою, щоб зумовити видиму реакцію з антигеном. Тому під час проведення серологічної реакції неадсорбовані сироватки обов'язково розводять до титру, вказаного на етикетці. Адсорбовані імунні діагностичні сироватки високоспеци-фічні. Неспецифічні антитіла з них видаляють методом адсорбції. Адсорбовані сироватки можуть бути монорецепторними (містять антитіла до одного антигену) і полівалентними (містять антитіла до 2 антигенів і більше). Титр антитіл в адсорбованих сироватках невисокий (від 1:20 до 1:320), тому їх не розводять. Адсорбовані сироватки використовують для проведення реакції аглютинації на склі з метою вивчення антигенної структури бактерій, тобто для серологічної ідентифікації культури. Ампули з ліофілізованими сироватками вміщують у коробки, в кожну коробку кладуть інструкцію щодо використання сироватки. На коробці зазначають назву сироватки, її призначення, кількість ампул, об'єм в 1 ампулі, серію, термін придатності, умови зберігання, адресу підприємства-виробника, крім того, для неадсорбованих сироваток зазначають титр. В інструкції зазначають: назву сироватки, її призначення, спосіб застосування, схему проведення серологічної реакції і врахування її результатів, термін придатності сироватки, умови зберігання і транспортування, адресу підприємства, що виготовило препарат. На ампулі зазначають: назву сироватки, об'єм, серію, контрольний номер, дату придатності, на ампулах з неадсорбованими сироватками — титр. Перед використанням звертають увагу на термін придатності, цілість ампули, чіткість підписів на ампулі, відповідність підпису на ампулі, інструкції й на коробці, фізичні властивості препарату (відповідність зовнішнього вигляду до зазначеного в інструкції) і розчиняють в об'ємі ізотонічного розчину натрію хлориду, який зазначено на етикетці. Проведення орієнтовної реакції аглютинації на склі. Облік та оцінка її результатів Аглютинація (від лат. agglutinatio — приклеювання) — це склеювання і випадання в осад клітин (у мікробіології — бактеріальних клітин) після їх взаємодії зі специфічними антитілами. Тому результатом реакції аглютинації є утворення пластівців унаслідок склеювання бактеріальних клітин. Осад в реакції аглютинації називається аглютинатом. Орієнтовна реакція аглютинації на склі частіше використовується для визначення антигенної структури мікроорганізмів, але інколи і для прискореної серологічної діагностики (реакція Хедельсона для діагностики бруцельозу). Проведіть орієнтовну реакцію аглютинації на склі та облік її результатів з метою ідентифікації культури бактерій. Проведення реакції аглютинації (РА) на склі з метою серологічної ідентифікації культури є завершальним етапом ідентифікації багатьох мікробних культур після попереднього їх вивчення за культуральними, морфологічними, тинкторіальними і ферментативними властивостями. Для постановки цієї реакції використовують інгредієнти: специфічну аглютинуючу адсорбовану сироватку (відоме антитіло), підготовлену згідно з інструкцією, ізотонічний розчин натрію хлориду і невідому, але підозрілу культуру (невідомий антиген). Алгоритм "Проведення та облік результатів орієнтовної РА": — знежирте предметне скло, нанесіть маркером три кола діаметром близько 1 см на однаковій відстані одне від одного, скло переверніть; — підпишіть: під І колом — Д (дослід), під II — КС (контроль сироватки), під III — КА (контроль антигену), зазначте номер аналізу; — зафламбуйте предметне скло, покладіть його у кришку чашки Петрі; — нанесіть пастерівською піпеткою на кола Д і КС по 1 краплі аглютинуючої сироватки, на коло КА — 1 краплю ізотонічного розчину натрію хлориду; — розітріть і змішайте бактеріологічною петлею досліджувану культуру з краплею ізотонічного розчину натрію хлориду (КА); — змішайте досліджувану культуру з краплею сироватки (Д); — оцініть результати через 1—3 хв; — помістіть предметне скло в дезінфекційний розчин. Увага! Оцінювання результату починають з оцінювання контролів: КА — рівномірне помутніння, КС — крапля прозора. У разі появи пластівців у колі Д на фоні прозорої рідини реакція позитивна (антиген відповідає антитілу), а в разі рівномірного помутніння — реакція негативна (антиген не відповідає антитілу). Іноді результат оцінюють за допомогою лупи або мікроскопа (реакція мікроаглютинації). Проведення розгорнутої аглютинації, Облік та оцінювання її результатів. Розгорнуту реакцію аглютинації здебільшого використовують для серологічної діагностики інфекційних хвороб: для діагностики черевного тифу — реакцію Відаля, для діагностики бруцельозу - реакцію Райта й інші, визначення титру імунної аглютинуючої сироватки. А також для серологічної ідентифікації культури бактерій ( Е. Соlі, бруцел). Для проведення розгорнутої реакції аглютинації з метою серологічної діагностики використовують такі інгредієнти: сироватку крові хворого (невідоме антитіло), діагностикум (відомий антиген) та ізотонічний розчин натрію хлориду. Для серологічного дослідження у хворого беруть кров на 5—7-й день від початку захворювання, коли в ній накопичиться достатня кількість антитіл; у реконвалесцента — з метою ретроспективного діагнозу; у здорової людини — з метою виявлення латентної інфекції або бактеріоносійства. Кров слід брати натще або не раніше ніж через 6 год після споживання їжі, оскільки в ній можуть накопичуватися краплі жиру, що робить сироватку каламутною (хільозна сироватка) та непридатною для дослідження. Найчастіше кров забирають із ліктьової вени або з пучки IV пальця, можна брати із мочки вуха, у дітей грудного віку — із п'ятки. Забір крові потрібно проводити в асептичних умовах та з дотриманням правил техніки безпеки. На суху чисту стерильну пробірку наклеюють етикетку, в якій зазначають: номер і назву матеріалу, заклад (відділення), або місце, де був взятий матеріал, прізвище, ім'я та по батькові хворого, дату і час взяття матеріалу. Окремо заповнюють бланк направлення встановленого зразка, в якому зазначають: номер і назву матеріалу, заклад (відділення) або місце, де був взятий матеріал, кратність направлення матеріалу (первинно чи повторно), прізвище, ім'я та по батькові хворого, його вік, дату захворювання, попередній діагноз, мету дослідження, дату і час взяття матеріалу, прізвище та посаду особи, яка направляє матеріал на мікробіологічне дослідження. Для постановки розгорнутої реакції аглютинації з метою серологічної діагностики використовують здебільшого стандартні антигени, які виробляють у науково-дослідних закладах. Вони містять інактивовані мікроорганізми або їх антигени. Ці антигени називають діагностикумами (від грец. diagnostikos — здатний розпізнавати). Діаностикуми для реакції аглютинації випускають у рідкому або ліофілізованому стані в ампулах або флаконах. Перед використанням діагностикум перевіряють на придатність. Звертають увагу на цілість посудини, чіткість надпису на ампулі чи флаконі, відповідність його надпису, зазначеному в інструкції та на коробці, відповідність зовнішнього вигляду до зазначеного в інструкції, термін придатності. Перед використанням рідкий діагностикум збовтують, ліо- філізований — розчиняють. Він повинен бути рівномірно каламутним, не утворювати пластівців. Розгорнуту реакцію аглютинації з метою серологічної діагностики проводять здебільшого для виявлення антитіл у сироватці крові хворого. Оскільки використовують нативну сироватку, перед постановкою реакції її розводять. Розведення сироватки називається титруванням. Алгоритм "Проведення розгорнутої реакції аглютинації": — підберіть 7 аглютинаційних пробірок однакового розміру, кольору скла, однакової конфігурації дна і 1 пробірку для робочого розведення; — візьміть стерильні градуйовані піпетки об'ємом 5 смЗ і 1 смЗ; 1 пастерівську піпетку; — поставте у штатив 3 стерильні пробірки і позначте, для яких піпеток вони призначені; — розгорніть стерильні піпетки і поставте у відповідні пробірки; ніння або осад у вигляді ґудзика, а під час збовтування утворюється рівномірне помутніння (реакція негативна). Потім оглядають дослідні пробірки, порівнюючи пробірки першу і другу, другу і третю, третю і четверту, четверту і п'яту. Увага! Піпетки мають зберігатися до кінця досліду! Увага! Діагностикум додається у кожну пробірку обов'язково в однаковій кількості! — струсіть пробірки та поставте їх у термостат (37 °С); — вийміть пробірки з термостата через 2 год; — проведіть попередній облік результатів, поставте пробірки в штатив і залиште їх за кімнатної температури; — проведіть остаточний облік результату реакції через 18— 20 год. Облік результату розгорнутої реакції аглютинації починають з контролю: КС — рідина прозора, КА — рівномірне помутніння або осад у вигляді ґудзиків, а під час забовтування утворюється рівномірне помутніння ( реакція негативна). Потім оглядають дослідні пробірки, порівнюючи пробірки першу і другу, другу і третю, третю і четверту, четверту і п'яту . Увага! У разі позитивної реакції утворюється осад, що покриває все дно пробірки у вигляді перевернутої парасольки, під час збовтування видно пластівці. Позитивним вважають результат з оцінкою осаду (++++) або (+++). Останнє розведення, в якому реакція аглютинації має позитивне значення, називається титром сироватки, його зазначають у відповіді. Здебільшого діагностичним вважають титр сироватки 1:100. Але ніколи не обмежуються одноразовим проведенням реакції аглютинації. Зазвичай її повторюють через 1—2 тиж. За наявності захворювання кількість антитіл (титр сироватки) у крові зростає, тому під час повторного проведення реакції аглютинації спостерігається наростання титру антитіл у сироватці у 2—4 рази. Це дає змогу відрізнити хворого від тієї людини, яка перехворіла або якій було зроблено щеплення. В останніх двох випадках зростання титру антитіл у сироватці крові не спостерігається. Заключний етап. Контроль рівня професійних вмінь і навичок. Тести 1. Під час серологічної діагностики у сироватці крові виявля- ють: а) невідоме антитіло; б) невідомий антиген; в) усі відповіді правильні. 2. Серологічна ідентифікація культури мікроорганізмів поля- гае у визначенні: а) антигенної структури; б) форми клітини; в) здатності розчинятися специфічним фагом; г) спорідненості до барвників. 3. Імунні діагностичні адсорбовані сироватки містять: а) відомий антиген; б) специфічні антитіла; в) неспецифічні та специфічні антитіла; г) всі відповіді правильні. 4. Кров на серологічне дослідження відбирають: а) у 1-й день захворювання; б) на 2-й день захворювання; в) наприкінці 1-го тижня захворювання; г) всі відповіді правильні. 5. Як діагностикум у серологічних реакціях можуть бути ви- користані: а) завис живих мікроорганізмів; б) завис убитих мікроорганізмів; в) окремі антигени мікроорганізмів; г) всі відповіді правильні. Ситуаційні задачі 1. Оцініть результати реакції аглютинації на склі із прозо¬рою краплею у КС: 1) у КА — рівномірне помутніння, у Д — пластівці; 2) у КА ІД — рівномірне помутніння; 3) у КА ІД — пластівці. 2. Під час проведення розгорнутої реакції аглютинації з си¬роваткою крові, відібраної на 6-й день хвороби, титр сироват¬ки з черевнотифозним діагностикумом виявився 1:50. Під час повторного проведення реакції через 2 тиж після першого титр сироватки становив 1:200. Як оцінити цей результат? 3. Під час проведення розгорнутої реакції аглютинації з сироваткою крові, відібраної на 6-й день хвороби, титр сироватки з черевнотифозним діагностикумом виявився 1:50, під час повторного проведення реакції через 2 тиж після першого титр сироватки становив 1:50. Як оцінити цей результат? 4. Під час проведення розгорнутої реакції аглютинації сироватку крові хворого розвели у співвідношенні від 1:50 до 1:1600. У першій і другій дослідних пробірках осад оцінюється (++++), У третій — (+++), у четвертій — (++), у п'ятій — (+), у шостій — (-). Який титр цієї сироватки? Література Основна Люта В.А., Кононов О.В. Мікробіологія: підручник. – К.: Медицина, 2008. – 157-162 с. Люта В.А., Кононов О.В. Практикум з мікробіології. – К.: Медицина, 2008. – 67-79 с. Ситник І.О., Климко С.І., Творко М.С. Мікробіологія, вірусологія, імунологія: підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 1998. Додаткова Воробьев А.А. и др. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. – М.: Медицинское информационное агенство, 2008. Воробьев А.А., Быкова А.С. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. – М.: Медицинское информационное агенство, 2003. Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією. – К.: Вища школа, 1992. Федорович У.М. Спеціальна мікробіологія. – ч. 1. – Л.: Євро світ, 1998. Федорович У.М. Спеціальна мікробіологія. – ч. 2. – Л.: Ахілл, 2001 Федорович У.М. Спеціальна мікробіологія, ч. 3. – Л.: Сплайн, 2008.