Викладач	Стоянова Л.П.
Предмет	Мікробіологія
Група	2 – А с/с
Дата	Згідно розкладу  01.06.2020
Тема Лекція12 1 година	Тема: Експерс методи діагностики вірусних інфекцій

СХЕМА ДИСТАНЦІЙНОГО НАВЧАННЯ

Які існують методи діагностики

Серологічні методи діагностики

Такі як реакція гальмування гемаглютинації (РГГА), реакція зв’язування комплементу (РСК), реакція непрямої гемаглютинації (РНГА), імуноферментний аналіз (ІФА) дозволяють визначати наявність антитіл до вірусів у сироватці крові хворих. Проте вони мають обмежене застосування для діагностики ГРВІ, тому що не можуть бути використані на ранніх стадіях захворювання. Це пов’язано з тим, що антитіла з’являються в крові через два тижні після інфікування, а до цього часу хворі, як правило, вже одужують і лабораторна верифікація інфекційного агента стає мало актуальною для хворого. Основне значення серологічних методів – це ретроспективна діагностика грипу та інших ГРВІ, що дозволяє побічно визначити спектр циркулюючих в людській популяції вірусів. Так само широко застосовуються серологічні методи і для оцінки поствакцинальної імунної відповіді.

Вірусологічні методи

Дозволяють виділити віруси від хворого, що робить можливим вивчати біологічні властивості вірусу. Ця інформація є важливою для зіставлення циркулюючих епідемічних штамів вірусу грипу і еталонних штамів, для розробки рекомендацій щодо лікування та хіміопрофілактики грипу, а також для визначення складу протигрипозної вакцини на майбутній епідемічний сезон. Виділення вірусів грипу проводиться на10-12 денних курячих ембріонах або на чутливій культурі клітин. Вірусологічне дослідження є найбільш тривалим, трудомістким дорогим методом, тому використовується тільки в епідеміологічній практиці і в наукових дослідженнях.

Широко використовуваний і доступний метод діагностики (реакція імунофлюоресценції – РІФ), для розшифровки етіології вірусних респіраторних захворювань має невисоку чутливістю, і результат аналізу в більшості випадків лікар отримує тільки через 2 – 3 дні. Це пов’язано не стільки з тривалістю самої РІФ, скільки з необхідністю транспортування досліджуваних зразків.

Метод ПЛР має високу чутливість з відносною швидкістю, що дозволяє з перших годин захворювання отримати вичерпну інформацію про збудника, прогнозувати характер перебігу і результат захворювання. Разом з тим, цей метод дорогий, і результат аналізу в більшості випадків лікар отримує через 2 – 3 дні, що для проведення специфічної терапії вже пізно, це ускладнює його використання в повсякденній клінічній практиці.

У літературі з’являється все більше відомостей про експрес-методи діагностики респіраторних вірусів, до яких відноситися імунохроматографічний тест. Метод простий, не вимагає для виконання спеціально навченого персоналу і може бути використаний для діагностики в польових умовах і у «ліжка хворого». Чутливість і специфічність цього методу складають 90-95%, а терміни ідентифікації вірусу можуть бути скорочені до 10-15 хвилин. У той же час по чутливості експрес-тести поступаються методу ПЛР. Тому лікар повинен мати на увазі, що негативний результат швидкого тесту не обов’язково означає відсутність інфекції. Крім того цей метод необхідно проводити при перших ознаках захворювання протягом перших 2 діб і на сьогодні, на жаль, він недоступний в широкій медичній практиці.

Таким чином, діагностика респіраторних вірусів вимагає часу. А лікувати ГРВІ та грип особливо необхідно вже в перші години, а не чекати, тому що симптоми інтоксикації (загальна слабкість, головний біль, нежить, кашель) значно прогресують і збільшується ризик розвитку ускладнень, особливо у дітей, літніх пацієнтів і вагітних.

Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій: реакція гальмування гемаглютинації, її механізм, умови постановки, принципи застосування, діагностична цінність.

Для лабораторної діагностики вірусних інфекцій використовуються різні методи.

Вірусологічне дослідження (світлова мікроскопія) дозволяє виявити характерні вірусні включення, а електронна мікроскопія – самі віріони, і за особливостями їх будови діагностувати відповідну інфекцію (наприклад, ротавирусную).

Вірусологічне дослідження спрямоване на виділення вірусу і його ідентифікацію. Для виділення вірусів використовують зараження лабораторних тварин, курячих ембріонів або культури тканин. Первинну ідентифікацію виділеного вірусу до рівня сімейства можна провести за допомогою: визначення типу нуклеїнової кислоти (проба з бромдезоксіурідоном), особливостей її будови (електронна мікроскопія), розміром віріона (фільтрування через мембранні фільтри з порами діаметром 50 і 100 нм), наявності суперкапсідную оболонки (проба з ефіром), гемагглютининов (реакція гемаглютинації),

типу симетрії нуклеокапсида (електронна мікроскопія).

Вірусологічне дослідження – це «золотий стандарт» вірусології і має проводиться в спеціалізованій вірусологічної лабораторії. В даний час воно використовується практично тільки в умовах виникнення епідемічного спалаху того чи іншого вірусного інфекційного захворювання. Для діагностики вірусних інфекцій широке застосування знайшли методи иммунодиагностики (серодиагностики і іммуноіндікаціі). Вони реалізуються в найрізноманітніших реакціях імунітету: радіоізотопний імунний аналіз (РІА), імуноферментний аналіз (ІФА), реакція імунофлюоресценції (РІФ), реакція зв’язування комплементу (РСК), реакція пасивної гемаглютинації (РПГА), реакції гальмування гемаглютинації (РГГА) та інші.

При використанні методів серодиагностики обов’язковим є дослідження парних сироваток. При цьому чотириразове наростання титру антитіл у другій сироватці в більшості випадків служить показником протікає або свежеперенесенной інфекції. При дослідженні однієї сироватки, взятої у гострій стадії хвороби, діагностичне значення має виявлення антитіл класу Ig М, яке свідчить про гостру інфекції.

РГА – це склеювання еритроцитів під дією вірусів. На поверхні деяких складних вірусів є рецептори – гемаглютиніни. Віруси адсорбуються на поверхню еритроцитів і завдяки гемаглютинінам викликають склеювання еритроцитів і утворення осаду з нерівним краєм.

РГадсорбціі – складні віруси при виході з клітини змінюють її мембрану, відбувається від брунькування.

До цих змінених місць можуть прикріплятися еритроцити.

Реакція гемаглютинації – феномен склеювання еритроцитів під впливом вірусів. Позитивна реакції – осад у вигляді «парасольки», негативна – у вигляді «гудзика».

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА). Реакція базується на здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою специфічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка аглютинації еритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі антигени (вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі клітин, лабораторних тваринах або курячому ембріоні, специфічні імунні противірусні (або проти окремих вірусних антигенів) сироватки, еритроцити. Для розведення компонентів реакції використовують забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові птахів (кури, гуси), ссавців (гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі промивають у стерильному фізіологічному розчині та зберігають у вигляді 0,5-1,0 % суспензії. З метою їх стабілізації еритроцити попередньо обробляють формаліном або глутаровим чи акриловим альдегідом.

Імунні сироватки попередньо позбавляють неспецифічних інгібіторів, прогріваючи при температурі 56 °С протягом 30 хв (для видалення термолабільних інгібіторів) або обробляючи розчинами перйодату калію чи натрію, бентонітом, каоліном, етакридину лактатом та іншими.

Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових планшетах з луночками. Постановці реакції передує визначення активності вірусного антигена, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують робочу дозу антигена, яка дорівнює від 4 до 8 ГАО (ГАО – гемаглютинуюча одиниця – максимальне розведення антигена, яке повністю аглютинує стандартну суспензію еритроцитів). Позитивною реакцією вважають утворення червоного зернистого з нерівними краями осаду, який дифузно розташовується на дні пробірки. Про негативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді “ґудзика” на дні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій аглютинації утворюється осад у вигляді кільця.

Реакція гальмування гемадсорбції (РГГ_адс). Принцип реакції базується на явищі гемадсорбції. Воно полягає в тому, що еритроцити набувають здатності адсорбуватись на поверхні культур клітин, які зазнали модифікації внаслідок появи в оболонці глікопротеїнів вірусів. Антитіла імунної сироватки при взаємодії з поверхневими антигенами вірусів, представленими в оболонці, зв’язують їх, внаслі­док чого гальмується адсорбція еритроцитів на клітинах.

Компонентами реакції є віруси, здатні до гемадсорбції, культура клітин, в якій вони розвиваються, противірусна сироватка з розведенням 1:10 і більше, 0,4‑1,0 % завись еритроцитів півня, гвінейської свинки або людини, тричі відмита фізіологічним розчином або розчином Хенкса. Специфічні сироватки, які використовують у досліді, попередньо обробляють ферментами, які руйнують рецептори, піддають температурному впливу, щоб звільнити від неспецифічних інгібіторів гемаглютинації.

Реакцію ставлять у пробірках або на спеціальних скляних пластинах, на яких є моношар культури клітин. Одна з переваг РГГ_адс полягає в тому, що її можна ставити до появи цитопатичного ефекту.

Попередньо заражають культуру клітин вірусмістким матеріалом та інкубують протягом деякого часу залежно від властивостей вірусу. Як контроль використовують культуру клітин, неінфіковану вірусами. Безпосередньо перед дослідом з пробірок видаляють живильне середовище, відмивають клітини від баластних речовин (білків) розчином Хенкса. У кожну дослідну пробірку додають по 0,6 мл розчину Хенкса і по 0,2 мл противірусної сироватки. У контрольні пробірки вносять по 0,8 мл розчину Хенкса та неімунну сироватку тварин. Пробірки інкубують нахиленими, щоб живильне середовище і сироватка омивали клітини, при кімнатній температурі протягом 15-30 хв. Потім в усі пробірки додають по 0,2 мл 0,4 % зависі еритроцитів, інкубують ще 20-30 хв при кімнатній температурі. Після цього пробірки обережно обертають в долонях 5-10 разів для ресуспендування еритроцитів та видалення їх з моношару культур клітин. Розглядаючи пробірки під малим збільшенням мікроскопа, звертають увагу на наявність чи відсутність адсорбції еритроцитів на поверхні клітин. При позитивній РГГ_адс еритроцити вільно плавають у живильному середовищі, при негативній – вони адсорбуються на клітинах. РГГ_адс використовують для ідентифікації збудників парагрипу, паротиту, респіраторно-синцитіальних вірусів та ін.

Література

                Основна

                Люта В.А., Кононов О.В. Мікробіологія: підручник. – К.: Медицина, 2008. – 359-408 с.

                Люта В.А., Кононов О.В. Практикум з мікробіології. – К.: Медицина, 2008.

                Ситник І.О., Климко С.І., Творко М.С. Мікробіологія, вірусологія, імунологія: підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 1998.

                Додаткова

                Воробьев А.А. и др. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. – М.: Медицинское информационное агенство, 2008.

                Воробьев А.А., Быкова А.С. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. – М.: Медицинское информационное агенство, 2003.

                Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією. – К.: Вища школа, 1992.

                Федорович У.М. Спеціальна мікробіологія. – ч. 1. – Л.: Євро світ, 1998.

                Федорович У.М. Спеціальна мікробіологія. – ч. 2. – Л.: Ахілл, 2001

                Федорович У.М. Спеціальна мікробіологія, ч. 3. – Л.: Сплайн, 2008.