Викладач	Стоянова Л.П.
Предмет	Мікробіологія
Група	2 – Б л/с
Дата	Згідно розкладу  15.09.2021
Тема Практика 1	Тема: Вступ до мікробіології .Охорона праці в галузі.Морфологія та фізіологія мікроорганізмів. Прості та складні методи забарвлення мазків.Поживні середовища. Техніка  посіву на живильні середовища..

 

 

Тема. Вступ до мікробіології .Охорона праці в галузі.

І. Актуальність: Мікробіологія – наука про дуже дрібні, невидимі неозброєним оком живі істоти (мікроорганізми). Розмір мікробів вимірюють в мікрометрах.

Медична біологія – це наука, що вивчає хвороботворні (патогенні) мікроорганізми, досліджує процеси, що виникають у макроорганізмі після проникнення в нього патогенних мікроорганізмів. Розробляє методи діагностики, створює препарати для специфічної профілактики. Щоб досягти успіхів у вирішенні проблем боротьби з інфекціями, потрібно добре знати морфологію, біологічні властивості збудників, їх екологію та взаємодію з організмом людини. Значення мікробіології для медпрацівників важливо. Вони повинні вміти проводити профілактичне обстеження людей, збирати патологічний матеріал у пацієнта, доставляти до лабораторії і вміти оцінювати результати досліджень. Знання мікробіології є базовими для вивчення клінічних дисциплін, інфектології, епідеміології та інш. предметів, щоб стати висококваліфікованим спеціалістом.

 

ІІ. Навчальні цілі: Ознайомитись з етапами розвитку мікробіології, з внеском вчених-мікробіологів у розвиток мікробіології.

Знати: завдання медичної мікробіології в боротьбі з інфекційними хворобами і освідомити необхідність вивчення мікробіології як базової науки для вивчення клінічних дисциплін.

Вміти: проводити профілактичне обстеження людей, збирати патологічний матеріал у пацієнта, доставляти до лабораторії і вміти оцінювати результати досліджень.

 

ІІІ. Виховні цілі: освідомити, що досягнення мікробіології дозволили в усьому світі ліквідувати натуральну віспу, чуму, поліомієліт та інш. Тому основна задача медпрацівників – це профілактика інфекційних хвороб внутрішньолікарняної інфекції і хвороб, спричиненими умовно-патогенними мікроорганізмами.

 

Обладнання: портрети видатних мікробіологів, структура мікробіологічної лабораторії, світовий мікроскоп, фарбовані препарати промислового виготовлення, інструкції з охорони праці і техніки безпеки при роботі в бактеріологічній лабораторії, знак „Біологічна небезпека”, презентація.

 

Міжпредметні зв’язки: біологія, хімія, анатомія, фізіологія, латинська мова, генетика, фармакологія.

План:

1. Організація та обладнання мікробіологічної лабораторії.

2. Завдання мікробіологічної лабораторії

3. Правила поведінки та техніка безпеки.

4. Основні методи мікробіологічних досліджень.

5. Класифікація найбільш поширених патогенних мікроорганізмів.

            6. Мікроскопія готових препаратів.

 

Мікробіологічні лабораторії організовують при лікарнях, поліклініках і санепідемстанціях.

Діагностика інфекційних хвороб. Для цього проводять виділення збудни­ка і визначають відповідь імунної системи організму на проникнення мікроор­ганізмів (серологічна діагностика).

Виявлення носіїв патогенних (хвороботворних) мікроорганізмів.

Дослідження з метою виявлення ступеня забрудненості мікробами різних об'єктів зовнішнього середовища.

Матеріалом для досліджень є найчастіше виділення людини (сеча, фека­лії, блювотні маси, виділення з ран), кров, жовч, спинномозкова рідина, проми­вні води шлунка, секційний матеріал та ін. Оскільки матеріал, який досліджу­ється, може мати збудників хвороб, він завжди вважається інфікованим, то під час роботи треба дотримуватись правил техніки безпеки.

Працівники лабораторії мають бути ознайомлені з правилами роботи, по­винні мати спецодяг і бути щеплені проти кишкових інфекцій.

1. Дотримуватись чистоти та порядку. На робочому столі не повинно бути зайвих речей.

2. У лабораторії заборонено куріння, вживання їжі та зайві розмови.

3. Посуд, у якому знаходиться матеріал, що надходить до лабораторії, про­тирають ззовні дезінфікуючим розчином, ставлять на спеціальний посуд, маркі­рують і реєструють у журналі.

4. Усі         предмети, що були використані при проведенні дослідження (піпетки, бактеріологічні петлі, предметні скельця та ін.), треба знезаражувати зразу ж над полум'ям спиртівки або дезінфікуючим розчином.

5.      Досліджуваний          матеріал переливати з однієї посудини в іншу можна лише над дезінфікуючим розчином.

6.      Коли       такий матеріал попаде на руки, стіл чи інші предмети, їх теж оброб­ляють дезінфікуючим розчином.

7.      При порушенні цілості пробірки або чашки з посівом мікроорганізмів, їх спочатку треба знезаразити, заливши дезінфікуючим розчином не менше ніж на 60 хв. (залежно від виду збудника), а потім прибирають.

8.      Після        закінчення роботи чашки з посівами ставлять у термостат; відпра­цьований матеріал знезаражують, а при необхідності ставлять у холодильник, який опломбовують. Робочі столи протирають дезінфікуючим розчином (3%-ним розчином хлораміну), роблять вологе прибирання лабораторії теж з дезін­фікуючим розчином, руки обробляють 0,2 %-ним розчином хлораміну.

 

Мікроскопія має такі етапи: а)підготовка мікроскопа (освітлення поля зору); б) мікроскопія; в) догляд за мікроскопом.

Підготовка мікроскопа

Поставте мікроскоп у зручну для роботи позицію, підніміть тубус; про­тріть оптичну систему простою тканиною; підніміть конденсор; відкрийте діа­фрагму конденсора; встановіть об'єктив х8; освітіть поле зору за допомогою дзеркала.

Мікроскопія

Спочатку на препарат нанесіть краплю імерсійної олії, потім скельце з препаратом покладіть на предметний столик. Об'єктив з малого збільшення пе­реведіть на велике (х9 МІ), обережно опустіть об'єктив мікрогвинтами у краплю імерсійної олії (дивлячись збоку, щоб не роздавити скло). Далі повільно підні­міть об'єктив макрогвинтами, доки не з'явиться зображення (дивіться в окуляр). Чіткість зображення встановіть за допомогою мікрогвинта. Таким же чином ви­значається форма мікроорганізмів, присутність у них спор і капсул.

Потім тубус макрогвинтом підніміть і препарат зніміть з предметного столика.

Догляд за мікроскопом

Об'єктив протріть марлевою серветкою і відкладіть на предметний сто­лик. Далі об'єктив переведіть на мале збільшення (х8), опустіть конденсор, за­крийте діафрагму і опустіть тубус.

 

У мікробіологічній практиці застосовують методи світлової, люмінесцен­тної, темнопольної та електронної мікроскопії. Частіше застосовують світлову мікроскопію.

Світловий мікроскоп складається з оптичної та механічної систем.

Будова світлового мікроскопа:

 

Механічна система: 1 - основа; 2 - тубусотримач; 3 - предметний столик; 4 - тубус; 5 - револьвер; 6 - гвинт для опускання конденсора; 7 - макрогвинт; 8 - мікрогвинт; 9 - гвинт для переміщення предметного столика.

~ Оптична система: 10 - окуляр; 11 - конденсор; 12 - об'єктиви (сухі та імерсійні); 13-дзеркала.

У роботі звично використовують сухі х8, х40 та імерсійний (х 90МІ) об'­єктиви. В останньому випадку між фронтальною лінзою та препаратом кла­деться імерсійна рідина, показник заломлення світла якої приблизно як у скла. Імерсійною рідиною може бути вазелінова, кедрова та інші олії.

Окуляри можуть давати такі збільшення: х7, хІО, х15. Загальне збільшен­ня мікроскопа дорівнює добутку збільшення об'єктива на збільшення окуляра (90x10=900).

 

Правила мікроскопіювання.

1.    При мікроскопію ванні, як джерело світла, вдень використовують віддзеркалене світло, ввечері - штучне джерело світла - матову електричну лампу. Пряме сонячне світло змягчують матовим склом, яке вставляють в конденсор, а штучне світло - блакитним склом.

2.     При розгляданні не зафарбованих препаратів використовують ввігнуте дзеркало, звужену діафрагму або опущений конденсор і сухі системи.

3.     Зафарбовані препарати мікроскопують при плоскім дзеркалі, піднятим конденсорі, відкритій діафрагмі й імерсійному об'єктиві. Об'єктив обережно опускають в олію під контролем ока. Тільки при близькому штучному джерелі світла або при слабкому освітленні використовують ввігнуте дзеркало.

4.     Рекомендується при мікроскопію ванні для запобігання втомлення зору обидва тримати відкритими.

5.     По закінченню мікроскопіювання піднімають тубус мікроскопа і здіймають препарат. М'якою чистою ганчіркою обтирають імерсійний об'єктив. Якщо олія засохла, лінзу обтирають ганчіркою, яка змочена спиртом або бензином.

6.     Необхідно обережно поводитися з об'єктивом та іншими оптичними частинами.

7.     Мікроскоп накривають ковпаком або зберігають у футлярі для захисту від пилу, світла, вологи.

Замалювати будову бактерій.

Записати у щоденник практичних занять практичні навички.

 

Тема. Морфологія та фізіологія мікроорганізмів. Прості та складні методи забарвлення мазків.

І. Актуальність:

Міліарди мікробів населяють стихії і оточують нас всюди, є супутниками людини на всьому її життєвому шляху, владно втручаючись у її життя, то як вороги, то як друзі. Вони зустрічаються у харчах, які ми споживаємо, у воді, яку ми п’ємо, в повітрі, яким ми дихаємо. Оточуючі нас предмети, наш одяг, поверхня нашого тіла – все це буквально кишить мікробами, серед яких зустрічаються і хвороботворні види” – мікробіолог Омелянський.

 

ІІ Навчальні цілі:

Ознайомитись з основами класифікаційних категорій мікроорганізмів.

 

Знати: структуру бактеріальної клітини, постійні та непостійні елементи. Основні фізіологічні функції мікробної клітини.

 

Вміти: проводити основні методи мікробіологічних досліджень – мікроскопічний метод дослідження.

 

ІІІ Виховні цілі: Формування у майбутніх медпрацівників сумлінного ставлення до своїх обов’язків при виконанні мікробіологічних досліджень. Дотримання правил охорони праці, техніки безпеки під час роботи з інфікованим матеріалом, лабораторним посудом, дезрозчинами, газовими пальниками.

 

Обладнання: світловий мікроскоп, імерсійне масло, в'язкий матеріал (мокротиння або гній), кров, бульйонна культура ешерихій, агарова культура стафілокока, ізотонічний розчин натрію хлориду, предметні стекла, пінцет, бактеріологічна петля, спиртівка, сірники, маркер, банка з ватою, посудина для фарбування, вода для промивання препаратів, барвники (фуксин Пфейффера, метиленовий синій, папірці, пофарбовані за Синьовим, розчин Люголя), 96 % етиловий спирт, фільтру­вальний папір для висушування препаратів, пуста чашка Петрі, гумові рукавички.

 

Міжпредметні зв’язки: біологія, хімія, анатомія, фізіологія, латинська мова, генетика, фармакологія.

Практичні навички:

—         навчитися виготовляти мазки-препарати для мікроско­пічного дослідження;

—         навчитися фарбувати мазки-препарати простим і склад­ними методами;

—   навчитися мікроскопіювати мазки-препарати;

—         навчитися трактувати результат мікроскопічного дослі­дження.

План

1.        Матеріал для мікроскопічного дослідження.

2.        Поняття про тинкторіальні властивості мікроорганізмів.

3.         Виготовлення мазків-препаратів із патологічного матері­алу.

4.         Виготовлення мазків-препаратів із культури мікроорга­нізмів.

5.        Фарбування препаратів простим методом і за Грамом.

Ознайомлення з методикою фарбування препаратів для виявлення капсул, кислото-, спирто- та лугостійких бак­терій, спор, включень.

            Мікроскопічний метод дослідження. Завдяки такому методу можна побачити будову мікроорганізмів і їх тинкторіальні властивості (здатність мікробів забарвлюватись).

А це дозволить підтвердити орієнтовний клінічний діагноз інфекційної хвороби (дифтерію, правець, тиф, лептоспіроз, гонорею, сифіліс та ін.).

Для проведення такого методу треба знати методи забарвлення, уміти го­тувати мазки - простим та складним методами, а також визначати морфологію та тинкторіальні властивості мікробів.

У лабораторії для проведення такого методу має бути таке оснащення: бульйонні та агарові культури кишкової палички і стафілокока, патологічний матеріал (кров, гній, мокротиння), предметні скельця, мікроскопи, бактеріоло­гічні петлі, дистильована вода, ізотонічний розчин хлориду натрію, піпетки, ба­рвники за Грамом, метиленовий синій, таблиці («Будова бактеріальної кліти­ни»; «Особливості будови грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів»; «Основні форми бактерій»).

Досліджують фіксовані забарвлені препарати і живі мікроорганізми («ви­сяча крапля», «роздавлена крапля», мікроскопія у темному полі зору). Фіксова­ний препарат готують так: 1 - роблять шок; 2 - фіксують; 3 - фарбують.

Приготування мазків.

Готують мазки з культури та патологічного матеріалу (кров, мокротиння, гній та ін.).

До приготування мазків предметні скельця знежирюють (натираються милом і ретельно протирають ватою або витримують у суміші Никифорова). Для приготування мазків часто використовують бактеріологічну петлю (трима­ють її, як авторучку. Петлю стерилізують у полум'ї спиртівки до і після викори­стання). Спочатку стерилізують робочу частину, тримаючи її вертикально, по­тім останню частину -горизонтальну, горизонтально проводять через полум'я.

Методика готування мазків

Мазки з культури мікроорганізмів роблять з агарової і бульйонної куль­тур.

З агарової культури: спочатку знежирюють предметне скло, позначають місце мазка № (спеціальним олівцем - маркером); далі скло фламбують. Стери­лізують і бактеріологічною петлею і (холодною) наносять краплю ізотонічного розчину хлориду натрію; знов стерилізують бактеріологічну петлю, відкрива­ють чашку Петрі, охолоджують петлю на внутрішній стінці чашки, потім бе­руть 1/3 частини ізольованої колонії і зразу закривають чашку. Забраний мате­ріал вносять у краплю ізотонічного розчину хлориду натрію і розтирають роз­міром монети однієї копійки; висушують на повітрі.

З бульйонної культури: зафламбовують і охолоджують бактеріологічну петлю; цією петлею наносять матеріал на знежирене предметне скло; розтира­ють бактеріологічною петлею краплю матеріалу (бульйонної культури) на цьо­му склі; висушують на повітрі.

Виготовлення мазків з нашивного матеріалу

З крові: знежирюють і зафламбовують два предметні скла; потім пасте­рівською піпеткою наносять краплю крові на одне скло ближче до правого кін­ця; друге скло кладуть на перше вузькою стороною у крарлю крові; після розті­кання крові проводять по першому склі справа наліво; висушують на відкрито­му повітрі. (Мазок має бути рожевим, рівномірно зафарбованим).

Товста крапля крові: знежирють і зафламбовують два предметних скла; на серцевину скла пастерівською піпеткою наносять краплю обстежуваного ма­теріалу; накривають другим склом, трохи притискають і розводять два скла в протилежні боки.

З мазків-відбитків із секційного матеріалу: поверхню органу припалю­ють гарячим скальпелем, вирізають скальпелем шматочок тканини; відбитки наносять на скло поверхнею зрізу у 2 - 3 місцях.

Фіксація мазків

Фіксацію здійснюють фізичним або хімічним способом. Фізичним спосо­бом фіксують мазки з мікробної культури. Для цього скельце з мазком на пове­рхні треба провести три рази над полум'ям спиртівки (приблизно 6 сек.). Хіміч­ним - фіксують мазки крові, тканин, мазки-відбитки та мазки з культури мікро­організмів, які змінюють морфологічні ознаки (капсульні мікроби, спірохети) під час нагрівання. Для цього мазок обробляють однією з фіксувальних рідин: метиловим (5 хв.) або етиловим спиртом (10 хв.), сумішшю Никифорова ( 15 — 20 хв.).

Забарвлення препаратів

Для забарвлення мазків використовують прості та складні (диференційні) методи забарвлення.

Завдяки складним методам можна розрізнити мікроорганізми або виявити їх структурні особливості.

До складних методів відносять такі:

1)   за Грамом - виявляють грампозитивні або грам негативні мікроорганіз­ми;

2)   за Ожешко - виявлення спор;

3)   за Буррі — Гінсом — виявлення капсул;

4)   за Цілем - Нільсоном - виявлення мікобактерій туберкульозу;

5)   за Романовським - Гімзою - виявлення спірохет, ріккетсій та ін.

Простий метод забарвлення: на препарат наносять фуксин Пфейфера (на

2 хв.) або метиленовий синій (на 3-5 хв.); далі промивають водою і висушують фільтрувальним папером.

Складний метод: на мазок наносять барвник генціановий фіолетовий або папір, зафарбований за Синьовим і змочують водою; потім пінцетом знімають папір, наносять розчин Люголя (на 1 хв. до почорніння); далі наносять 96% - ний етиловий спирт (на 20-30 сек.), промивають водою; далі наносять фуксин Пфейфера (на 2 хв.), добре промивають водою і висушують фільтрувальним папером.

 

1. Матеріал для мікроскопічного дослідження

Виявлення патогенних мікроорганізмів в патологічному ма­теріалі за допомогою мікроскопа називається мікроскопічним методом лабораторної діагностики. Для мікроскопії викорис­товують мокротиння, гній, кров, осад спинномозкової рідини і сечі, мазки зі слизових оболонок, зскрібок з уражених ділянок шкіри, уражене волосся, нігті, а також відбитки уражених ор­ганів.

2. Поняття про тинкторіальні властивості мікроорганізмів

Мікроорганізми мають настільки малі розміри, що ви­вчати їх у незабарвленому вигляді під світловим мікроско­пом неможливо, до того ж вони прозорі. Тому частіше їх вивчають у забарвленому стані. Вивчення мікроорганізмів у пофарбованому препараті дає змогу не тільки вивчити їх форму, розміщення, а й виявити деталі структури клітини (спору, капсулу), а також хімічний склад, через те, що різні хімічні речовини проявляють різну спорідненість до барвни­ків і після фарбування мають різний колір або різну інтен­сивність забарвлення.

Здатність мікроорганізмів сприймати барвники називають тинкторіальною (від лат. tinctura — настоянка) властивістю.

3. Виготовлення мазків-препаратів із патологічного матеріалу

Для виявлення мікроорганізмів у патологічному матеріалі готують мазки на предметному склі. Предметні стекла готують заздалегідь. Їх миють, знежирюють і зберігають в етиловому спирті або суміші Нікіфорова (суміш етилового спирту та діети­лового ефіру 1:1) у широкогорлій банці з притертою пробкою. Перед роботою їх витирають насухо. Тримати скло слід І і II пальцями лівої руки за ребра.

Виготовте мазок із в'язкого матеріалу (мо­кротиння або гною).

Увага! Під час роботи з патологічним матеріалом дотри­муйтесь техніки безпеки.

Алгоритм "Виготовлення мазка із в'язкого матеріалу":

—     протріть насухо 2 знежирених предметних стекла;

—     поставте свій номер у верхньому лівому куті кожного скла;

—     нанесіть пастерівською піпеткою патологічний матеріал на середину скла;

—     накрийте його другим склом так, щоб 1/3 частина кож­ного скла була вільною, злегка притисніть;

—     розведіть стекла в різні сторони, взявши їх за вільні кінці І і II пальцями обох рук;

—     залиште мазки на столі для висихання.

Виготовте мазок із крові.

Алгоритм "Виготовлення мазка із крові":

—     підготуйте 2 предметних стекла (одне з них повинно бути вужчим і мати шліфований вузький кінець);

—     поставте свій номер на ширшому склі;

—     нанесіть краплю крові пастерівською піпеткою на шир­ше скло ближче до правого кінця; поставте друге скло

 

шліфованим кінцем у краплю крові, нахиліть його впра­во під кутом 45°;

проведіть ним по першому склу справа наліво на 3/4 скла (мал. 6);

опустіть вузьке скло в дезінфекційний розчин; залиште мазок на столі для висихання.

Увага! Правильно виготовлений мазок повинен мати світло-рожеве забарвлення і бути рівномірним за товщиною.

Виготовте препарат "товста крапля".

Алгоритм "Виготовлення препарату "товста крапля":

—     підготуйте 2 предметних стекла;

—     поставте свій номер на одному з них;

—   нанесіть пастерівською піпеткою краплю крові на сере­дину підписаного скла;

—   розмажте цю краплю кутом другого скла до величини мо­нети вартістю 1 копійка;

—     опустіть друге скло в дезінфекційний розчин;

—     залиште препарат на столі для висихання.

Ознайомтеся з методикою виготовлення маз­ків із слизу, взятого із ротоглотки (зіва), мазків-від битків з органів і тканин, сечі, спинномозкової рідини.

1.       Виготовлення мазка із слизу, взятого з ротоглотки.

Мазок із ротоглотки беруть стерильним тампоном з мигда­ликів, роблять мазок на предметному склі, висушують на пові­трі, фіксують хімічним способом.

2.          Виготовлення мазків-відбитків з органів і тканин секцій­ного матеріалу.

Поверхню органа припалюють нагрітими бланшами пінцета або нагрітим скальпелем. Зрізають поверхневий шар. З глиби­ни вирізають невеликий шматочок тканини, беруть її пінцетом і прикладають поверхнею зрізу до предметного скла декілька разів. Отримують послідовний ряд мазків-відбитків. Мазки фіксують хімічним способом.

3. Виготовлення мазків із сечі, ліквору (від лат. liguor — спинномозкова рідина).

Маленьку краплю рідини (сечі чи ліквору) бактеріологіч­ною петлею наносять на предметне скло і розмазують до розмі­ру монети вартістю 1 копійка. Висушують на повітрі, фіксують хімічним методом.

Увага! Мазки, виготовлені з в'язкого матеріалу і крові, після перевірки викладачем опустіть у дезінфекційний роз­чин.

4. Виготовлення мазків із культури мікроорганізмів

Мазки з культури мікроорганізмів виготовляють для ви­вчення їх морфології та тинкторіальних властивостей.

Увага! Під час роботи з живими культурами ретельно до­тримуйтесь правил техніки безпеки.

Виготовте мазок із бульйонної культури.

Алгоритм "Виготовлення мазка із бульйонної культури

—     підготуйте предметне скло, нанесіть контури майбутньо­го мазка;

—     переверніть скло (нанесений контур знизу);

—     у лівому верхньому куті скла поставте свій номер;

—     зафламбуйте скло у полум'ї спиртівки (скло тримати пін­цетом);

—    покладіть скло у кришку чашки Петрі;

—     зафламбуйте бактеріологічну петлю, візьміть бульйонну культуру;

—     нанесіть краплю культури на предметне скло, розітріть;

—     зафламбуйте бактеріологічну петлю;

—     залишіть мазок для висихання.

Увага! Висушувати мазки слід на повітрі. Під впливом високої температури структура мікробної клітини порушу­ється.

Виготовте мазок з агарової культури.

Алгоритм "Виготовлення мазка з агарової культури":

—     підготуйте предметне скло, нанесіть контури майбутньо­го мазка;

—     переверніть скло (нанесений контур знизу);

—     у лівому верхньому куті скла поставте свій номер;

—     зафламбуйте скло у полум'ї спиртівки (скло тримати пін­цетом);

—     зафламбуйте бактеріологічну петлю;

—     нанесіть краплю стерильного ізотонічного розчину на­трію хлориду на предметне скло;

—      зафламбуйте бактеріологічну петлю;

—     відкрийте лівою рукою чашку Нетрі з ростом культури мікроорганізмів;

—     притуліть бактеріологічну петлю до стінки чашки Петрі (охолодження петлі);

—     візьміть петлею матеріал з однієї колонії;

Увага! Слід брати колонію мікроорганізмів, а не агар!

закрийте чашку Петрі;

нанесіть матеріал на суху поверхню скла поряд із кра­плею ізотонічного розчину натрію хлориду, розітріть; рівномірно розмішайте матеріал із краплею ізотонічного розчину натрію хлориду; зафламбуйте бактеріологічну петлю; залишіть мазок для висихання.

Увага! Мазок має бути тонким, прозорим, рівномірним, невеликим.

Фіксування мазків. Мазки фіксують для: закріплення мате­ріалу на склі, знезараження, кращого фарбування (вбиті мікро­би краще поглинають барвник).

Для фіксації мазків використовують два способи: фізичний і хімічний.

Фізичний спосіб. Фіксацію проводять у полум'ї спиртівки протягом 6 с. Для цього скло беруть пінцетом або І і II пальця­ми правої руки і проводять тричі повільно через верхню части­ну полум'я мазком догори. Правильність фіксації перевіряють,

торкаючись нижньою поверхнею скла тильної сторони лівої руки. Мазок повинен бути гарячим, але не обпікати руку.

Цим методом фіксують мазки, виготовлені з культури мі­кроорганізмів, за умови, що під час нагрівання не змінюється структура мікробної клітини.

Хімічний спосіб. Для фіксації використовують хімічні речо­вини: безводний метиловий спирт — фіксують протягом 5 хв, спирт етиловий 96 % — 10—15 хв, суміш Нікіфорова — 10— 15 хв, ацетон — 5 хв, суміш парів хлоридної кислоти і формалі­ну — декілька секунд.

Хімічним способом фіксують мазки, виготовлені із патоло­гічного матеріалу, а також з культури в тому разі, коли під час нагрівання може порушитися структура бактеріальної клітини (капсульні форми бактерій, спірохети).

Зафіксований мазок називається препаратом.

Зафіксуйте мазки, виготовлені з агарової і бульйонної культури, фізичним способом.

Алгоритм "Фіксація мазка фізичним способом":

—     візьміть пінцетом предметне скло з висушеним мазком;

—     проведіть тричі через верхню частину полум'я спиртів­ки;

—     доторкніться нижньою поверхнею скла до тильної сторо­ни лівої руки (перевірка правильності фіксації).

Увага ! Забороняється залишати на відкритих місцях або в неопечатаних сховищах незафіксовані мазки після закін­чення роботи!

5. Фарбування препаратів простим методом і за Грамом

Під час простого методу фарбування використовують один барвник — частіше це фуксин Пфейффера або метиленовий си­ній. Цей метод ще називається орієнтовним, оскільки його ви­користовують тільки для виявлення мікробів у патологічному матеріалі, визначення їх кількості, форми, взаємного розташу­вання.

Пофарбуйте препарат, виготовлений з буль­йонної культури, фуксином Пфейффера, та препарат, виго­товлений із агарової культури, метиленовим синім.

Алгоритм "Фарбування препарату простим методом"і

—    помістіть препарат на підставку в посудину для фарбу­вання;

—    нанесіть барвник піпеткою так, щоб він закрив весь пре­парат;

—    проконтролюйте термін дії барвника (фуксин Пфейффе­ра __ 1_2 ХВ, метиленовий синій — 3—5 хв);

—     промийте препарат водою;

—     висушіть препарат фільтрувальним папером.

Метод фарбування мазків-препаратів за Грамом належить до складних методів, тому що на мазок наносять два барвни­ки, один з яких є основним, а інший — додатковим. Ці методи називають ще диференціальними, оскільки вони дають змогу розрізнити окремі групи бактерій, а також виявити хімічний склад і структуру бактеріальної клітини.

Під час фарбування за Грамом бактерії поділяють на 2 гру­пи: грампозитивні (забарвлюються в фіолетовий колір) та грамнегативні (забарвлюються в червоний колір). Різний колір за­барвлення пояснюється різною будовою їх клітинної стінки. Основну частину клітинної стінки грампозитивних бактерій складає пептидоглікан — понад 90 %. Він має форму сітки. У грампозитивних бактерій він утворює 5—6, інколи до 40 шарів. Коли бактерії фарбують генціановим фіолетовим, а потім розчи­ном Люголя, то утворюється нерозчинний у спирті і воді комп­лекс йоду з барвником. Цей комплекс не вимивається спиртом і водою через слабку проникність клітинної стінки (пептидоглі- кану). Грампозитивні бактерії залишаються забарвленими у фі­олетовий колір. Дофарбовування препарату фуксином Пфейф­фера не змінює фіолетового кольору клітин мікрооганізмів.

У грамнегативних бактерій пептидоглікан утворює пере­важно один шар, зрідка — два. Тому комплекс генціанового фіолетового з йодом легко вимивається спиртом і водою, вна­слідок чого бактерії знебарвлюються. Знебарвлені бактерії за­барвлюються фуксином Пфейффера у червоний колір.

Алгоритм "Фарбування за Грамом

—     покладіть на мазок папірець, пофарбований за Синьовим, змочіть його водою — 2—3 краплі, витримайте 2 хв;

—     зніміть папірець пінцетом, нанесіть розчин Люголя — 1 хв (до почорніння);

—     нанесіть 96 % етиловий спирт — 20—30 с;

—     промийте водою;

—     нанесіть фуксин Пфейффера на 1-2 хв.

—     промийте водою;

—     висушіть препарат фільтрувальним папером.

Підготуйте мікроскоп, розгляньте препа­рат, визначте форму, розміщення та колір бактеріальних клітин.

6. Ознайомлення з методикою фарбування препаратів для виявлення капсул, кислото-, спирто- та лугостійких бактерій, спор, включень.

Для виявлення капсул, кислото-, спирто- та лугостійких бактерій, спор і включень використовують складні методи фар­бування.

Для виявлення капсул препарат фарбують за Буррі—Гінсом. Для цього на предметному склі культуру змішують із краплею чорної туші, потім роблять мазок іншим предметним склом (як мазок із крові), висушують на повітрі, фіксують хімічним спо­собом і, після промивання водою, наносять фуксин Пфейффера. Потім знову промивають водою і висушують на повітрі. Капсу­ли містять понад 98 % води, тому погано утримують барвник. На темному фоні препарату капсули залишаються безбарвни­ми, клітини бактерій набувають червоного кольору.

Для виявлення кислотостійких мікобактерій туберкульозу, лепри, а також деяких актиноміцетів застосовують фарбування препарату за Цілем—Нільсеном. У цих мікроорганізмів у клі­тинній стінці міститься багато (понад 40 %) ліпідів, воску, окси­кислот, що зумовлює їх стійкість до кислот, лугів, спиртів. Вона також малопроникна для розведених барвників, тому для фарбу­вання використовують концентрований барвник (фуксин Ціля), іцо містить протраву (5 % фенолу). Фарбування проводять при нагріванні (в кип'ячому шарі). За таких умов всі елементи пре­парату (клітини макроорганізму, стороння мікрофлора і кисло­тостійкі мікобактерії) набувають червоного кольору. Після обро­блення препарату сульфатною кислотою і водою кислотостійкі мікобактерії залишаються червоного кольору, всі інші елементи препарату знебарвлюються. Другим барвником, розведеним ме­тиленовим синім, фарбують без підігрівання, тому він всереди­ну клітини кислотостійких мікобактерій не проникає і вони не змінюють червоного забарвлення. Всі інші знебарвлені елементи препарату набувають синього кольору. При мікроскопії на синьо­му фоні видно кислотостійкі мікобактерії червоного кольору.

Для виявлення спор препарат фарбують за Ожешко. Щоб барвник проник всередину спори, перед фарбуванням мазок обробляють кислотою для розпушування оболонки спори. Піс­ля промивання водою його фіксують і фарбують за Цілем— Нільсеном. Вегетативні клітини набувають синього кольору, спора — червоного.

Для виявлення включень препарат фарбують за Нейссером. Для цього на препарат наносять синьку Нейссера, потім розчин Люголя, після промивання водою на препарат наносять барв­ник везувін і знову промивають водою. Вегетативна клітина на­буває жовтого кольору, зерна волютину — темно-коричневого. Цей метод фарбування використовують для виявлення зерен волютину (у коринебактерій дифтерії).

Оформіть щоденник. Замалюйте в щоден­нику кольоровими олівцями вигляд мікроорганізмів під мі­кроскопом.

Контрольні запитання

1.         Яким вимогам мають відповідати предметні стекла, які використовують для виготовлення мазків?

2.         Як виготовити мазок із в'язкого матеріалу?

3.          Як виготовити із крові мазок, "товсту краплю"?

4.          Як виготовити мазки із слизу, рідини?

5.         Як виготовити мазки-відбитки з тканин і органів?

6.         Яка різниця у виготовленні мазків з бульйонної та агаро­вої культури?

7.          З якою метою фіксують мазки?

8.           Які є способи фіксації мазків? У яких випадках їх засто­совують?

9.           Чим відрізняється препарат від мазка?

10.           Чому не дозволяється залишати на відкритих місцях незафіксовані мазки?

11.           Які властивості мікроорганізмів називають тинкторі- альними?

12.           Від чого залежить вибір барвника і методів фарбування мікроорганізмів?

13.           Що таке простий метод фарбування? Які барвники для цього використовують?

14.           Які методи фарбування називають складними? Чому їх називають диференціальними?

15.           На які групи поділяють бактерії у разі фарбування за Грамом?

16.           Чому під час фарбування за Грамом бактерії забарвлю­ються у фіолетовий або червоний колір?

17.           Яку структуру бактеріальної клітини можна виявити у разі фарбування за Буррі-Гінсом?

18.           Чому капсули не забарвлюються?

19.           Які мікроорганізми виявляють у разі фарбування пре­парату за Цілем—Нільсеном?

20.           Чому кислотостійкі бактерії не забарвлюються розведе­ними барвниками?

21.           Чому під час фарбування за Цілем—Нільсеном різні бактерії забарвлюються в різний колір?

22.           Які структури бактеріальної клітини виявляють у разі фарбування за Ожешко?

23.           Для чого використовують фарбування за Нейссером? Який вигляд мають бактерії, пофарбовані цим мето­дом?

Тести

1. Мазок перед фіксацією висушують:

а)    на повітрі;

б)    над полум ям спиртівки;

в)    за допомогою фільтрувального паперу;

г)    всі відповіді правильні.

2.       Не можна фіксувати фізичним способом мазок, виготовле­ний із:

а)     бульйонної культури стафілокока;

б)     агарової культури стафілокока;

в)     крові.

3.       Під час фарбування за Грамом грампозитивні бактерії набу­вають кольору:

а)     червоного;

б)     синього;

в)     фіолетового;

г)     блакитного.

4.       Структура, від якої залежить фарбування мікроорганізмів за Грамом:

а)     ліпополісахарид;

б)     цитоплазматична мембрана;

в)     пептидоглікан;

г)     поверхнева мембрана.

5.       Для виявлення капсули у бактерій препарат фарбують за:

а)     Буррі—Гінсом;

б)     Грамом;

в)    Цілем—Нільсеном;

г)     Ожешко.

6.       Для виявлення мікобактерій туберкульозу препарат фарбу­ють за:

а)     Буррі—Гінсом;

б)     Грамом;

в)     Цілем—Нільсеном;

г)     Ожешко.

7.       Для виявлення спори препарат фарбують за:

а)     Буррі—Гінсом;

б)     Грамом;

в)     Цілем—Нільсеном;

г)     Ожешко.

Ситуаційні задачі

1. У пофарбованому препараті виявили кулясті бактерії фіолетового кольору та паличкоподібні - червоного кольору. За яким методом пофарбований препарат?

2.      У препараті, пофарбованому за Грамом, виявили бактерії кулястої форми, розміщені ланцюжком, фіолетового кольору, і паличкоподібні бактерії, розміщені безладно, червоного кольо­ру. Які бактерії за формою, розміщенням, фарбуванням вияви­ли в препараті?

3.        У пофарбованому препараті виявили бактерії червоного кольору з безбарвним ободком. За яким методом пофарбовано препарат?

4.      У пофарбованому за Нейссером препараті, виготовленому із слизу, взятого з ротоглотки, виявили паличкоподібні бакте­рії з потовщенням на кінці. Палички пофарбовані в жовтий ко­лір, потовщений кінець — у темно-коричневий. Яка причина нерівномірного фарбування бактеріальних клітин?

5.          Під час культивування грампозитивних стрептобацил сибірки за наявності пеніциліну паличкоподібна форма клітин змінюється на кулясту внаслідок того, що не синтезується клі­тинна стінка (феномен "перлинного намиста"). Як називається ця форма бактерій? Який колір мають ці клітини в препараті після фарбування за Грамом? Чому?

6.         У препараті з мокротиння, пофарбованому за Цілем— Нільсеном, виявлено коки, розташовані у вигляді грона вино­граду, синього кольору, поодинокі короткі товсті палички си­нього кольору, тонкі довгі палички червоного кольору. До яких груп належать виявлені бактерії за формою клітини, розміщен­ням, фарбуванням?

7.       Відомо, що мікобактерії туберкульозу після фарбування за Цілем—Нільсеном мають червоний колір. Якого кольору в препараті, пофарбованому за Цілем—Нільсеном, будуть міко­бактерії туберкульозу в L-формі? Чому?

Тема.  Поживні середовища. Техніка  посіву на живильні середовища..

Мета заняття:

уміти проводити взяття та посів патологічного матеріалу на поживні середовища;

уміти характеризувати ріст мікроорганізмів на пожив­них середовищах.

Оснащення: сухі та виготовлені поживні середовища: поживний бульйон, Ендо, ЕМС (Левіна), Гісса, виготовлене середовище ЖСА, бактеріологічні петлі, шпатель для посіву, тампон для зіва, бульйонна культура ешерихій (посівний матеріал), середовище Ендо, кров'яний агар, ЖСА, кольоровий ряд Гісса, МПБ з індикаторними паперовими смужками з ростом культури бактерій, спиртівка, сірники, маркер, гумові рукавички.

Контроль вихідного рівня знань

 

1.                Бактеріологічний метод дослідження. Його значення для діагностики інфекційних хвороб.

2.                Ознайомлення з поживними середовищами. Їх характеристика.

3.                Поняття про культуральні та біохімічні властивості мікроорганізмів.

4.                 Техніка посіву патологічного матеріалу на поживні середовища бактеріологічною петлею, тампоном, шпателем.

5.                 Принципи культивування аеробних і анаеробних мікроорганізмів.

6.                  Етапи виділення чистої культури мікроорганізмів. Ідентифікація чистих культур мікроорганізмів.

7.                У якому вигляді випускають сухі поживні середовища?

8.                 Які дані про поживне середовище наведені на етикетці?

9.                 Який матеріал використовують для посіву на поживні середовища?

10.             Яких правил посіву слід дотримуватися, щоб отримати ізольовані колонії?

11.            Яких правил слід дотримуватися під час посіву живої культури?

12.           Як підписати чашку Петрі після посіву?

13.            Яка техніка посіву патологічного матеріалу петлею (на щільне і рідке поживне середовище), тампоном, шпателем?

14.             Як забезпечити необхідні умови культивування аеробних і анаеробних мікроорганізмів?

15.            Як правильно розмістити чашки Петрі в термостаті?

16.            З якою метою визначають ферментативну активність мікроорганізмів?

17.            Які групи ферментів враховують під час визначення ферментативної активності?

18.             На яких середовищах і як визначають сахаролітичні ферменти мікроорганізмів?

19.             На яких середовищах і як визначають протеолітичні ферменти мікроорганізмів?

20.             Як визначають гемолітичну властивість мікроорганізмів ? Які бувають види гемолізу?

21.             Як визначають лецитиназну активність мікроорганізмів?

 

Формування професійних вмінь і навичок

Ознайомтеся з формою випуску, умовами зберігання сухих поживних середовищ.

Сухі поживні середовища випускаються у флаконах із темного скла, пластика або у непрозорих пакетах, зроблених із щільного паперу, алюмінієвої фольги (середовища світлочутливі). ГІосуд, у якому випускають ці середовища, щільно закривають, пробки додатково заливають парафіном, пакети запаюють (середовища гігроскопічні). На флаконах і пакетах обов'язково має бути етикетка, на якій зазначено: назву середовища, призначення, склад, спосіб приготування, термін і умови зберігання, серію. Готують поживні середовища згідно з інструкцією, зазначеною на етикетці.

Техніка посіву патологічного матеріалу на поживні середовища бактеріологічною петлею, тампоном, шпателем

Проведіть посів бактеріологічною петлею на щільне поживне середовище Ендо.

Посів на поживні середовища проводять для бактеріологічного дослідження з метою виділення чистої культури мікроорганізмів та її ідентифікації. Для посіву може бути використаний як патологічний матеріал, так і культура мікроорганізмів.

Чисту культуру виділяють з однієї колонії, тому посів роблять так, щоб виросли ізольовані колонії. Для цього використовують такі прийоми: поверхня середовища має бути підсушеною (не повинно бути крапельок конденсаційної вологи), посівний матеріал — розведеним і добре розмішаним, лінія посіву — максимально довгою.

Всі маніпуляції, пов'язані з посівом і виділенням культур мікроорганізмів, проводять в асептичних умовах. Під час посіву не розмовляють, не роблять зайвих рухів; роботу виконують швидко, посіви тримають не далі ніж на 10 см від полум'я.

Увага! Під час роботи з живою культурою дотримуйтеся правил техніки безпеки!

Алгоритм "Посів на щільне поживне середовище бактіріологічною петлею ":

—                поставте чашку Петрі донизу дном зліва від спиртівки;

—                зафламбуйте бактеріологічну петлю, візьміть матеріал для посіву із пробірки;

Увага! Матеріал для посіву в кільці бактеріологічної петлі утворює плівку "дзеркальце".

підніміть правою рукою кришку чашки Петрі так, щоб в щілину між кришкою та її дном пройшла бактеріологічна петля;

втирайте патологічний матеріал бактеріологічною петлею в поверхню поживного середовища біля краю чашки;

—                зафламбуйте бактеріологічну петлю;

—                охолодіть бактеріологічну петлю, доторкнувшись її кінцем до внутрішньої сторони стінки чашки Петрі;

покладіть бактеріологічну петлю на те місце на поверхні середовища, де нанесли патологічний матеріал;

—                продовжіть робити посів штрихами по всій поверхні чашки, не відриваючи петлі від середовища;

Увага! Штрихи наносять через всю поверхню середовища від однієї стінки чашки до іншої (протилежної) і розташовують їх якомога ближче один від одного. Завдяки цьому лінія посіву стає якнайдовшою, що дає змогу отримати ізольовані колонії.

—                закрийте чашку Петрі;

—                зафламбуйте бактеріологічну петлю, поставте її в банку;

—                закрийте спиртівку;

підпишіть на кришці чашки назву поживного середовища і дату його виготовлення;

переверніть чашку дном догори, підпишіть номер, дату посіву, назву культури за бінарною номенклатурою.

Увага! Підпис посуду здійснюється відповідно до Державних санітарних правил (ДСГІ 9.9.5.-080-02).

Проведіть посів бактеріологічною петлею у рідке поживне середовище (МПБ).

Під час посіву у МПБ матеріал розітріть на сухій внутрішній поверхні пробірки біля середовища, нахиліть пробірку і змийте матеріал у середовище. Цієї вимоги слід дотримуватися обов'язково, особливо у випадках посіву в'язкої культури.

Алгоритм "Посів петлею у рідке поживне середовище": — візьміть бактеріологічну петлю в праву руку, зафламбуйте її;

—                візьміть чашку Петрі з культурою у ліву руку;

—                охолодіть петлю, доторкнувшись до внутрішньої стінки чашки;

—                заберіть матеріал з однієї колонії;

—                поставте чашку Петрі, візьміть пробірку з МПБ;

—                візьміть мізинцем правої руки пробку пробірки і притисніть її до долоні;

Увага! Пробку постійно тримайте в руці.

—                зафламбуйте отвір пробірки;

тримайте пробірку біля полум'я так, щоб отвір її був не далі як на 10 см від полум'я;

—               уведіть петлю в пробірку, розітріть на її стінці матеріал; опустіть петлю в поживне середовище, змийте матеріал зі стінки

пробірки;

—                вийміть петлю з пробірки, не торкаючись її стінок;

—                зафламбуйте отвір пробірки, закрийте її пробкою; — поставте пробірку у штатив:

—               зафламбуйте петлю, поставте її в склянку з інструментом.

Ознайомтеся з видами тампонів, що використовуються для взяття патологічного матеріалу.

Посів проводять тампоном, яким було відібрано матеріал для дослідження. Тампони виготовляють шляхом намотування вати на металевий, скляний або дерев'яний стержень. Тампони бувають для зіва (ротоглотки) і носа, а також ректальні (для взяття патологічного матеріалу із прямої кишки). Тампони для ротоглотки і носа виготовляють так: на кінчик стержня туго намотують вату, а посередині його роблять ватну пробку. Вата кінчика і пробки не повинна сполучатися між собою, в іншому випадку, якщо такий тампон опустити в рідке поживне середовище, то воно, за законом капілярності, буде поглинуте тампоном. Ці тампони використовують для взяття патологічного матеріалу не тільки з ротоглотки, носа, а й з вуха, виразки, абсцесу, рани, а також для взяття змивів з рук і поверхні різних об'єктів навколишнього середовища. Ректальні тампони виготовляють так: туго намотують вату на кінці стержня, потім навколо стержня на довжину 10—12 см, потім роблять ватну пробку. Виготовлені тампони вміщують у пусті чисті сухі пробірки і стерилізують у автоклаві за температури 120 °С протягом 20 хв.

 

Принципи культивування аеробних і анаеробних мікроорганізмів

Умови, необхідні для культивування мікроорганізмів у мікробіологічній лабораторії, забезпечуються в термостаті.

Ознайомтеся з будовою термостату, поставте посіви у термостат.

Термостат призначений для підтримання у внутрішній частині робочої камери стабільної температури, необхідної для проведення бактеріологічних і серологічних досліджень.

Основними частинами термостату є: корпус, металеві дверцята, прозорі дверцята, робоча камера, блок управління. Корпус виготовлений із тонколистового металу. Всередині корпусу встановлена робоча камера, в нижній частині якої закріплені два нагрівальних елементи. Простір між корпусом і камерою заповнений теплоізоляційними прокладками, зробленими з гофрованого картону. Корпус закривається металевими дверцятами.

Металеві дверцята зроблені у вигляді двохстінної коробки з тонколистового металу. Простір між двома стінками заповнений ізоляційними прокладками.

По периметру дверцят укріплена гумова магнітна прокладка для ущільнення між дверцятами і корпусом термостата. На дверцятах і корпусі є два гвинти з отворами для проволоки, на яку вішають пломбу.

Прозорі дверцята дають змогу спостерігати за процесом у робочій камері, не відкриваючи їх і не порушуючи температурний режим.

Прозорі дверцята по периметру обклеєні прокладкою з гуми для ущільнення між дверцятами і робочою камерою.

Робоча камера має прямокутну форму, її стінки виготовлені з латуні. У верхній частині камери встановлено датчик температури. Для усунення місцевого перегрівання бічні стінки і дно камери обклеєні азбестовим папером. Температурний режим у робочій камері контролюється термометром, який встановлюється через отвір, що розміщений у блоці керування. Всередині камери встановлено металеві полички з отворами для полегшення циркуляції повітря.

Блок керування призначений для автоматичного регулювання та підтримання температури в робочій камері. На панелі блоку керування встановлено тумблер, запобіжники, кнопковий замикач, сигнальну лампу включення в електромережу і одночасно для підсвічування шкали термометра; сигнальну лампу включення нагрівальних елементів термостата, ручки резисторів для встановлення температурного режиму.

Алгоритм "Підготовка термостата до роботи":

—                перевірте, чи заземлений термостат;

—                підключіть апарат до електромережі, поверніть тумблер убік напису "мережа" (рос. мовою — "сеть") — сигнальна лампочка світиться у напівнакалі;

—      поверніть ручку резистора, встановіть потрібну температуру;

—                відкрийте дверцята;

—                поставте чашки Петрі в робочу камеру термостата догори дном;

Увага! Чашки Петрі розміщують на поличках і дні робочої камери гіркою оптимально не більше ніж по 5 штук, нещільно, що забезпечує циркуляцію повітря і рівномірне нагрівання всіх чашок. Чашки обов'язково ставлять догори дном. Це забезпечує добру аерацію чашок і запобігає потраплянню конденсаційної води з кришки чашки на посів, яка перешкоджає утворенню ізольованих колоній.

—               закрийте прозорі дверцята;

—                закрийте металеві дверцята.

Для успішного культивування мікроорганізмів у лабораторних чи промислових умовах потрібно правильно підібрати поживні середовища, правильно виконати посів і створити належні умови для культивування:

оптимальну температуру, відсутність світла, вологість, аерацію або відсутність повітря (кисню), витримати певний термін культивування. Оптимальну температуру створюють у термостаті. Більшість патогенних мікробів ростуть за температури 37 °С.

Для більшості мікроорганізмів, у тому числі і патогенних,, світло не потрібне, тому їх культивують у темряві (термостат має непрозорі стінки). Вологість — неодмінна умова розвитку мікроорганізмів, тому їх краще висівати на свіжовиготовлені середовища.

Аерація необхідна для культивування облігатних аеробів і факультативних анаеробів. У пробірки кисень разом із повітрям проникає через ватно-марлеві пробки, у чашки Петрі — через щілину між кришкою і дном чашки. Облігатні анаероби культивують в умовах повної відсутності кисню в поживних середовищах і навколишньому просторі. Для цього використовують різні методи для видалення кисню із середовища і запобігання насиченню середовища киснем. В умовах лабораторії рідкі поживні середовища регенерують — кип'ятять для видалення кисню, різко охолоджують, засівають і заливають на висоту 1 см стерильним вазеліновим маслом або роблять посів уколом у високий стовпчик агару, інколи агаром з посівом заповнюють трубки і запаюють їх на кінцях. Анаеробні умови можна створити в анаеростаті, де культивують мікроби у вакуумі або атмосфері іншого газу (азоту, пропану тощо), а також в ексикаторі. З повітря, що міститься в ексикаторі, кисень поглинають хімічні речовини або запалена свічка.

Деякі мікроорганізми краще культивуються в атмосфері, що містить 5—10 % вуглекислого газу. Це капнофільні мікроорганізми (бруцели, менінгококи). Термін культивування для різних мікробів різний. Більшість патогенних мікробів культивують протягом 18—24 год, але деякі ростуть повільніше: бордетели — 3—4 доби, спірохети — 7—12 днів, мікобактерії туберкульозу — до 3 міс.

Етапи виділення чистої культури мікроорганізмів. Ідентифікація чистих культур мікроорганізмів

Вивчіть принципи виділення та ідентифікації чистої культури мікроорганізмів.

В організмі людей, тварин, у навколишньому середовищі патогенні мікроорганізми змішані з умовно-патогенними та сапрофітами, тому виділення чистої культури мікроорганізмів є обов'язковим етапом бактеріологічного (культурального) дослідження. Це дає змогу ідентифікувати її за певними властивостями.

На щільних поживних середовищах мікроорганізми утворюють колонії. Вважають, що колонія — це видиме скупчення мікроорганізмів, які виросли з однієї клітини, тому чисту культуру виділяють шляхом посіву матеріалу з однієї ізольованої колонії. Виділення чистої культури та її ідентифікацію проводять у декілька етапів: 1 -й етап — посів патологічного матеріалу на поживні середовища з метою отримання ізольованих колоній (вибір методу культивування, склад поживного середовища залежить від типу живлення і дихання мікроорганізмів);

2-        й етап — визначення характеру росту мікроорганізмів на поживних середовищах (культуральних властивостей), відбір характерних колоній;

3-        й етап — визначення морфології і тинкторіальних властивостей мікроорганізмів;

4-        й етап — пересівання підозрілих колоній з метою виділення чистої культури мікробів;

5-        й етап — перевірка чистоти виділеної культури;

6-        й етап — визначення ферментативних властивостей мікроорганізмів;

7-        й етап — визначення точних маркерів мікроорганізмів: антигенної структури, фагочутливості, коліциногенності, антибіотикограми тощо. Характер росту мікроорганізмів на поживному середовищі визначає їх культуральні властивості. Ці властивості постійні для кожного виду мікроорганізмів, тому є важливою ознакою під час їх ідентифікації.

Культуральні властивості мікроорганізмів.

У рідких поживних середовищах мікроорганізми можуть утворювати помутніння, осад, плівку, пристінковий ріст.

На щільних поживних середовищах вивчають колонії неозброєним оком, через лупу або під мікроскопом, результати відмічають у робочому журналі. Характеризують колонії за розміром, формою, контуром краю, прозорістю, рельєфом, характером поверхні, кольором, структурою, консистенцією. За розміром колонії бувають: точкові (діаметр менший ніж 1 мм), дрібні (діаметр 1—2 мм), середнього розміру (діаметр 2—4 мм), великі (діаметр 4— 6 мм і більше).

Форма колоній буває: правильна — кругла, неправильна — амебоподібна, ризоїдна (нагадує переплетене коріння дерева).

Контур краю визначають неозброєним оком або під мікроскопом. Він може бути рівний і нерівний. Нерівний край буває: фестончастий — утворює великі заокруглені зубці правильної форми; хвилястий — великі заокруглені зубці виражені нечітко; зазубрений — зубці гострі, різної величини і форми; бахромчастий — має ніжні ворсинки; розпливчастий — важко відрізнити межу між колонією і поживним середовищем.

За прозорістю колонії бувають: прозорі, напівпрозорі, непрозорі, прозорі або напівпрозорі з непрозорим центром.

Рельєф колоній вивчають неозброєним оком або через лупу, розглядаючи колонію згори і збоку. За рельєфом колонії бувають: каплеподібні і куполоподібні — мають правильну округлу форму у вигляді сегмента кулі, можуть бути слабовипуклі і випуклі; плосковипуклі — випуклі з плоскою верхівкою, у вертикальному розрізі нагадують трапецію; конусоподібні — у вертикальному розрізі нагадують трикутник; плоскі або випуклі з центром у вигляді сосочка; випуклі з вдавленим центром; плоскі — розстилаються по поверхні середовища.

Поверхня буває матовою або блискучою, сухою або вологою, гладенькою або шорсткою. Колонії з гладенькою поверхнею позначають буквою S (від англ. smooth — гладенький), з шорсткою — буквою R (від англ. rough — шорсткий).

Колір колоній зумовлений пігментом, який продукує культура мікроорганізмів. Переважна більшість патогенних мікробів не утворюють пігмент, тому їх колонії безбарвні, у проникаючому світлі вони прозорі, напівпрозорі або непрозорі. Колонії пігментоутворюючих мікроорганізмів мають різний колір: жовтий, оранжевий, червоний, чорний, фіолетовий тощо. Так, синьогнійна паличка утворює колонії синьо-зеленого кольору, а стафілококи — білого і жовтого.

Структура колоній визначається під мікроскопом. У непрозорих колоній вона не визначається. За структурою розрізняють такі види колоній: гіалінові — без видимої певної структури; зернисті — залежно від розміру зерен можуть бути дрібно і грубозернистими; волокнисті — наявність волокон усередині колонії.

Колонії також можуть бути однорідні і неоднорідні. В однорідних будова колонії у всіх її частинах однакова, у неоднорідних центральна частина або сектор відрізняється від іншої частини колонії.

Консистенція — це фізичний стан колонії. її визначають за допомогою бактеріологічної петлі. За консистенцією колонії бувають: пастоподібні (нагадують вершкове масло), легко знімаються; в'язкі або слизькі, прилипають і тягнуться за петлею; волокнисті, шкірясті, щільні — знімаються з поверхні поживного середовища у вигляді плівки, відповідно до розміру і форми колонії; крихкі, сухі — розсипаються у разі торкання петлею.

Вивчіть способи виявлення ферментативної активності мікроорганізмів.

Здатність виробляти ферменти (ферментативна активність) у мікроорганізмів кодується генами і є їх постійною індивідуальною ознакою. За ферментативною активністю відрізняються не тільки окремі види мікробів, а й окремі варіанти одного виду. Вони називаються біоварами. Тому вивчення ферментативної активності мікроорганізмів є важливим етапом ідентифікації культури. Ферментативна активність мікробів багата і різноманітна, але в лабораторній практиці враховують не всі ферменти, що виробляють мікроби, а тільки ті, за якими можна диференціювати генетично близькі між собою види. Найчастіше вивчають ферменти, здатні розщеплювати вуглеводи (сахаролітичні), білки (протеолітичні), сечовину (уреазу), розщеплювати лецитин (лецитиназу), ферменти, що зумовлюють окисно-відновні властивості мікробів (дегідрази, каталазу, оксидазу), а також токсини, що руйнують еритроцити (гемолітичні властивості).

Сахаролітичну активність виявляють на поживних середовищах, що містять певний вуглевод чи багатоатомний спирт (у мікробіологічній практиці вуглеводи і багатоатомні спирти об'єднують в одну групу). Під впливом сахаролітичних ферментів вуглеводи розщеплюються до кислоти і газу (С02, Н2, СН4). Для виявлення кислот до поживних середовищ додають індикатор. Накопичення газу виявляють у напіврідкому середовищі за появою кульок газу в середовищі, розривом середовища, піноутворенням. Цей принцип покладено в основу використання диференціально-діагностичних середовищ Ресселя, Гісса, Ендо, ЕМС та ін.

На середовищі з крохмалем визначають здатність мікроорганізмів продукувати фермент амілазу, що супроводжується гідролізом крохмалю, — у разі додавання розчину Люголю до засіяного середовища реакція на крохмаль стає негативною (тобто під дією йоду середовище не синіє). На середовищі з молоком визначають здатність мікроорганізмів продукувати фермент лактазу, що розщеплює молочний цукор лактозу до кислоти або до кислоти і газу. При цьому молоко зсідається, утворюється казеїн (зсілий білок молока).

Протеолітичну активність мікроорганізмів визначають на середовищах, що містять желатин, молоко, сироватку крові, білок курячого яйця, шматочки вареного м'яса, пептон.

Для виявлення ферменту желатинази мікроби засівають уколом на поживне середовище (м'ясопептонний желатин), ін-кубують за температури 22 °С або 37 °С протягом від 1 до 20 діб. Характер розрідження желатину, спричинений різними мікробами, різний. Так, холерний вібріон зумовлює розрідження желатину у вигляді лійки (суцільне розрідження), збудник сибірки — у вигляді перевернутої ялинки (розрідження шарами).

У середовищі з молоком мікроорганізми, які утворюють протеолітичні ферменти, пептонізують казеїн. Тому рідке молочне середовище стає напівпрозорим, має вигляд молочної сироватки.

Протеолітично активні мікроби гідролізують білки до індолу, сірководню, аміаку. Індол утворюється внаслідок розщеплення амінокислоти триптофан. Для виявлення індоло-утворення у пробірку із середовищем, в яке засіяна культура досліджуваних мікроорганізмів, вносять індикаторну паперову смужку, просякнуту розчином щавелевої кислоти. Під дією індолу смужка паперу набуває блідо-рожевого кольору. Сірководень можна визначити за допомогою індикаторної паперової смужки, просякнутої розчином свинцю ацетату. Під дією сірководню утворюється свинцю сульфід — речовина чорного кольору, внаслідок чого папірець також набуває чорного кольору. Гемолітичні властивості мікробів, тобто здатність руйнувати еритроцити, визначають на поживних середовищах із кров'ю. Розрізняють два види гемолізу: альфа і бета-гемоліз. Якщо мікроорганізми спричинюють альфа- гемоліз, то на кров'яному агарі навколо колоній утворюється зелена зона (часто в такий самий колір забарвлюється і колонія) внаслідок перетворення гемоглобіну на метгемоглобін. У разі бета-гемолізу утворюється прозора зона навколо колонії.

Лецитиназну активність, здатність руйнувати лецитин у мембранах клітин визначають на середовищах із жовтком курячого яйця. Якщо мікроорганізми утворюють фермент леци-тиназу, навколо колоній утворюється райдужний вінчик.

Фермент плазмокоагулазу вивчають на середовищі, що містить цитратну плазму крові. Через 2—3 год культивування в термостаті за температури 37 °С плазма зсідається (не виливається з перевернутої пробірки). Уреазну активність визначають на середовищах, що містять сечовину. Оскільки уреаза розщеплює сечовину до вуглекислого газу й аміаку (вуглекислий газ погано розчиняється у воді, а аміак — дуже добре), середовище набуває лужної реакції, на що вказує зміна кольору індикатора.

Заключний етап. Контроль рівня професійних знань і навичок.

Тести 1. Номер аналізу підписують: а) на кришці чашки Петрі; б) на дні чашки Петрі; в) не має значення. 2. Чашки Петрі з посівом ставлять у термостат: а) догори кришкою; б) догори дном; в) не має значення. 3. Мікроби, що обов'язково ростуть за наявності кисню: а) мікроаерофіли; б) облігатні анаероби; в) облігатні аероби; г) факультативні аероби. 4. Фактор, що не потрібен для культивування мікробів: а) оптимальна температура; б) вологість; в) повітря; г) світло. 5. Середовища, найбільш сприятливі для певного виду мікробів а) спеціальні; б) елективні; в) селективні; г) основні.

 

6. Фермента, що розщеплюють білки:

а)         протеолітичні;

б)         сахаролітичні;

в)         уреаза;

г)         гіалуронідаза.

Ситуаційні задачі

                        1. У поживне середовище з молоком висіяли культуру мікроорганізмів. Через деякий час середовище стало напівпрозорим. Що стало причиною зміни вигляду середовища?

                        2. Після посіву харчових продуктів, підозрілих щодо харчового отруєння, у

поживному середовищі з молоком через 4 год утворився пухкий згусток казеїну, а пробки повилітали з пробірок. На які властивості бактерій вказують ці факти?

                        3. Після посіву мокротиння хворого на пневмонію на поживне середовище з кров'ю виросли дрібні, вологі, зеленкуваті колонії, навколо яких середовище позеленіло. Дайте пояснення цьому явищу.

                        4. Через добу після посіву на середовище Гісса з лактозою було виявлено, що бактерії виросли вздовж уколу, середовище залишилося прозорим і колір його не змінився. Як оцінити цей результат?

                        5. Під час зняття пов'язки з гнійної рани було відмічено, що бинти набули синьо-зеленого кольору і запаху суничного мила. Чи можна орієнтовно зробити висновок про те, які бактерії спричинили загнивання рани?

 

 

 

Література

            Основна

            Люта В.А., Кононов О.В. Мікробіологія: підручник. – К.: Медицина, 2008. – 6-57 с.

            Люта В.А., Кононов О.В. Практикум з мікробіології. – К.: Медицина, 2008. – 9-26 с.

            Ситник І.О., Климко С.І., Творко М.С. Мікробіологія, вірусологія, імунологія: підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 1998.

            Додаткова

            Воробьев А.А. и др. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. – М.: Медицинское информационное агенство, 2008.

            Воробьев А.А., Быкова А.С. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. – М.: Медицинское информационное агенство, 2003.

            Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією. – К.: Вища школа, 1992.

            Федорович У.М. Спеціальна мікробіологія. – ч. 1. – Л.: Євро світ, 1998.

            Федорович У.М. Спеціальна мікробіологія. – ч. 2. – Л.: Ахілл, 2001

            Федорович У.М. Спеціальна мікробіологія, ч. 3. – Л.: Сплайн, 2008.